In-Cell Western 免疫熒光定量分析信號轉導

In-Cell Western 免疫熒光定量分析信號轉導

In-Cell Western（ICW）是一種用于定量檢測細胞內蛋白表達量或信號傳導的方法，既簡單又經濟高效。ICW檢測方法將細胞接種在微孔板中，然后進行固定/通透化，利用特異性一抗，紅外染料偶聯的二抗體進行標記。通過Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統獲取熒光信號，可以精確測量細胞信號通路的誘導或抑制，并能夠在單個孔板上進行多種處理和多次重復。 

ICW技術中免疫熒光檢測

在生命科學研究領域，尤其是信號轉導和磷酸化蛋白的分析中，蛋白表達水平的量化越來越重要。這些研究中通常需要分析許多樣品，密切的檢查信號轉導事件的事件，并評估各種實驗條件。In-Cell Western（ICW）定量免疫熒光測定法，簡化的實驗流程，可以并行處理并檢測多個試驗樣品，高通量進行實驗程序和數據分析。微孔板檢測將Western Blot的特異性與ELISA的重現性、高通量相結合，能夠有效的定量多個樣品中相對蛋白水平和信號轉導事件。In-Cell Western技術也被稱為cytoblots（細胞印跡），細胞ELISA（cLISA），細胞內ELISA（ICE）或FACE（基于快速激活的細胞ELISA）。

圖1. ICW技術示意圖。在96孔板或384孔板中培養細胞，并進行固定和通透處理，再通過IRDye偶聯的二抗，通過免疫熒光檢測靶蛋白的熒光信號，對微孔板進行成像并量化信號強度。

     ICW技術基于標準的免疫熒光技術，二抗中標記了近紅外熒光染料，兩種NIR熒光染料能夠被檢測器檢測，提供雙通道檢測信號，使用Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統（Azure Biosystems）對每個孔中細胞群體的熒光信號成像，得到檢測結果。ICW使用近紅外的原因是，在近紅外波長范圍中，塑料，細胞，化學試劑的自發熒光背景很低，背景值遠低于可見光波長范圍。因此定量Western檢測中，非常適合使用近紅外波長進行檢測。

ICW檢測可以使用3種熒光通道進行檢測，一種可見光熒光通道可用于針對細胞染色或總蛋白染色進行歸一化（normalize），以通過校正孔與孔之間細胞數的差異來提高準確性。被研究的兩種靶蛋白使用2個近紅外熒光通道進行檢測，類似于近紅外熒光Western Blot，可以同時檢測兩種目的蛋白。對于磷酸化蛋白分析，一個紅外通道檢測靶蛋白，另一個紅外通道檢測磷酸化靶蛋白。

圖2：ERK的磷酸化對信號通路刺激的響應。 用EGF刺激A431細胞。 （a）用磷酸-ERK抗體（綠色； 800nm）檢測到ERK磷酸化。 還檢測到每個孔中的ERK總水平（紅色； 700 nm）。 重疊圖像中的黃色表示700和800 nm信號重疊。 在96孔板的一部分中顯示了兩排孔。 （b）熒光定量。 將磷酸ERK信號相對于總ERK信號進行歸一化，以校正細胞數之間的差異。 與靜止狀態相比，EGF刺激的細胞顯示ERK磷酸化增加> 16倍。

轉載自：Analytical Biochemistry 338：136–142.

Western Blot的替代方法

ICW檢測可以作為Western Blot（WB）的替代方法。在ICW檢測中，數百種樣品能夠被快速檢測，靶蛋白在固定的細胞中進行原位檢測，輸出高精度、量化數據結果。而在WB檢測中，蛋白經歷了細胞裂解，電泳和膜轉移步驟，這些步驟費時費事，而且引入很多變量降低了檢測精度。在微孔板中，少量固定劑就能夠終止細胞活動，保存細胞內容物。ICW能夠均勻、精確的終止實驗反應；隨著時間的推移，動態分析細胞信號轉導事件，并且實驗重復性更好。由于實驗過程中引入的變量減少，ICW分析的標準差低于Western印跡（圖3；WB分析的CV = 0.27； ICW分析的CV = 0.08-0.16）。 WB的變異性和誤差增加可能會掩蓋蛋白質表達水平的統計學顯著變化，而這些蛋白質表達水平的統計學變化能被ICW捕捉到。

圖3. WB和ICW分析中的變異性比較。 用催產素刺激子宮肌細胞的原代培養。 然后使用WB和ICW分析，在重復樣品中檢測GAPDH和PMLC 20的水平。 （a）將兩個相同的蛋白質印跡的條帶強度繪制為兩個印跡中每個印跡的13個樣品的平均值的比例（印跡1為藍色；印跡2為紅色）。 CV為0.27。 （b）來自兩個ICW板的重復孔的信號強度，以兩個板中每個板的平均值的比例繪制（板1為藍色；板2為紅色）。 CV范圍為0.08至0.16。

轉載自： PLoS One 5(4):e9965

ICW檢測結果中的信號增減與WB相似，IC50值也相似，但是標準差更小。在評估EGF受體抑制劑的實驗中，ICW檢測得到的IC50數值與發表文獻一致。384孔的ICW功能測定，用于監測多巴胺D2和D2 G蛋白偶聯受體（GPCR）的藥理作用。 GPCR激動劑誘導ERK磷酸化，pERK作為細胞內生化標記物，用于評估多巴胺D2和D3受體激動劑和拮抗劑。 這種非放射性測定的結果與其他功能測定相當。 由于ERK是一種內源性報告蛋白，因此無需進行細胞修飾即可導入嵌合G蛋白或報告基因。  另一項GPCR激活研究直接將ICW檢測技術與公認的cAMP結合和積累分析技術進行了比較。 CREB磷酸化作為內源性A 2A受體激活的標志，其結果與放射性配體結合研究和cAMP免疫分析的結果密切相關。

ICW檢測的應用

圖4. 用Wnt3a刺激細胞后，β-連環蛋白積聚的動力學。 （a）用ICW測定法評估細胞β-連環蛋白的時間和劑量依賴性積累。 將L細胞與Wnt3a孵育，然后對β-catenin（合并圖像中的黃色）和DNA含量（紅色）染色。 （b）定量β-連環蛋白的積累。 在Wnt3a刺激的30分鐘內，該水平被上調，在6至8小時之間顯示出增加的強度，并在10小時后開始達到平穩狀態。 圖顯示了兩個獨立的實驗，每個實驗一式四份。

轉載自：PLoS One 3(10):e3498

ICW檢測提供了一種整體測量的“快照”式結果，在細胞固定的那一刻，進行信號轉導和蛋白表達狀態的檢測。對于貼壁細胞研究，ICW分析是流式細胞術的一種便捷替代方法，對于不需要高含量篩選（high  content  screening ：HCS）的研究，提供了一種低成本的替代方案。ICW檢測適用于監視蛋白質水平和磷酸化狀態，但不能微觀分析單個細胞的特征，例如蛋白質易位或細胞形狀。 ICW分析已用于分析：1. 蛋白質的磷酸化和信號傳導，2. 藥物對信號通路的脫靶作用，3. 信號事件的時機和動力學（ 圖4），4. 病毒載量的定量分析，5. 遺傳毒性測定和細胞增殖測定，6. 幽門螺桿菌誘導的上皮信號轉導原位分析，7. 糖蛋白分析，8. 文庫篩選和9.單克隆抗體克隆的篩選。

使用Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統進行ICW實驗

材料和方法

培養細胞

連續稀釋HeLa細胞，并以每孔0.2 mL的體積接種到96孔無菌組織培養板中，并生長至約80％匯合。 固定所有孔，并在室溫下使用100％甲醇滲透15分鐘。

In-cell Western（ICW）實驗

固定和透化后，將細胞在PBS中沖洗，在室溫下用PBS中的1％魚明膠封閉1小時，然后在4°C下過夜孵育α-微管蛋白和β-肌動蛋白一抗。 用PBS洗滌樣品3次，再與AzureSpectra 550和AzureSpectra 800偶聯的二抗孵育60分鐘。

二抗體與RedDot?1核染色一起孵育，以使總細胞數歸一化。板塊在成像前，用PBS洗滌樣品3次。

成像

洗滌后，使用板焦點設置選項，在Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統上對微孔板進行成像。

結果與結論

在本實例中，我們展示了使用Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統，原位定量細胞內蛋白質的能力。 HeLa細胞在96孔板中生長，先用α-微管蛋白和β-肌動蛋白抗體檢測，然后用分別與AzureSpectra 550和AzureSpectra 800偶聯的同種型合適的二抗進行探測。 將所有孔與RedDot?1核染色液一起溫育以標準化總細胞數。 圖像使用Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統采集，顯示在圖6中。所示的代表性圖像證明了Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統可以實現的高靈敏度和特異性的信號采集。

在96孔板上進行細胞ICW分析可準確測定細胞內蛋白質的原位表達； 并提供了一種高通量方法，可評估多種刺激，多個終點，目的蛋白的表達水平，并能在單個孔板上重復實驗結果。 通過使用NIR抗體和Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統，還可以進行多重分析，從而進一步提高了通量。

圖5.  將連續稀釋的HeLa細胞播種到96孔板中，培養，固定和透化。A）列1-3使用AzureSpectra 550（綠色）染料檢測β-肌動蛋白。B）第3-6列用AzureSpectra 800（藍色）染料檢測α-微管蛋白。C）整個板塊用RedDot1核染色作為歸一化對照（紅色）。D）各個通道同時掃描，然后用Sapphire Capture軟件合并成一個單一的復合圖像。

Sapphire雙模式多光譜激光成像系統是新一代的激光掃描成像系統，提供無與倫比的靈敏度、超高的分辨率、更寬的動態范圍、提供更高質量數據。

● 唯一使用掃描式和CCD檢測雙模式的分子成像系統

● 唯一使用PMT，APDs和CCD三種檢測器進行信號采集的系統

● 分辨率可達10μm，分辨更細節

● 動態范圍可達6logs，定量更準確

● 軟件界面友好，易于使用