CUY21EDITⅡ電轉儀制備CRISPR基因編輯工程小鼠

Nature Protocol：i-GONAD技術詳解

CUY21EDITⅡ電轉儀原位遞送RNPs至受精卵制備CRISPR基因編輯工程小鼠

摘要：

創建基因工程小鼠的傳統方法包括三個主要步驟：1. 從一組雌性動物中收獲胚胎，2. 將試劑微注射到離體胚胎中，3. 然后通過外科手術將其轉移到另一組雌性動物中，盡管繁瑣，但這些方法已經使用了三十多年。研究者最近開發了一種名為GONAD的方法（genome editing via oviductal nucleic acids delivery），該方法繞開了這些步驟。GONAD技術將將CRISPR成分（Cas9 mRNA和guide RNA（gRNA））注入孕后1.5d孕鼠的輸卵管，通過CUY21EDITⅡ電轉儀，在體內電穿孔將這些核酸組分原位遞送到受精卵中，使用GONAD證明了靶基因可以在小鼠胚胎發育的不同階段被破壞和分析。

現在，研究者開發了改良版GONAD（i-GONAD）。 通過CUY21EDITⅡ電轉儀導入CRISPR RNPs（RNPs：Cas9蛋白/Cpf1蛋白 + gRNA）進入第0.7天孕鼠體內，使其適合常規基因導入，提供單鏈DNA（ssDNA）修復模板后，i-GONAD還可以生成包含多達1kb插入片段的敲入模型，基因編輯效率更高。i-GONAD還具有其他優勢：不需要切除輸卵管或子宮，使用i-GONAD的雌鼠不會被處死，還可以用于其他實驗，掌握小動物手術的研究人員在沒有精密顯微注射設備的實驗室中就能輕松進行，高效同時也節省成本。

這個protocol提供了建立GONAD方法的分步方案，該方案需要約6周的時間來生成G0代基因工程小鼠。

整個i-GONAD技術的流程中不需要精密的顯微注射步驟，需要的儀器僅為體式顯微鏡（Olympus, model no. SZ11)）和CUY21EDITⅡ電轉儀，以及一些常用的手術器械。

關鍵的電轉步驟如圖所示

上圖顯示體內電轉的示意圖（步驟22–26）。a. 用一塊濕的Kimwipe毛巾覆蓋輸卵管。b. 將電極浸入滅菌PBS中。c.將電極放置在被Kimwipe覆蓋的輸卵管上，以抓住組織，使用CUY21EDITⅡ電轉儀進行電轉（ 左）和輸卵管的電轉（右）。d. 最好用蘸有70％（vol/vol）乙醇的棉布擦拭電極的內表面，以清潔后再用于輸卵管。

在不同的實驗條件下，對8至10周齡的C57BL / 6J雌性小鼠進行實驗，使用CUY21Edit II電轉儀進行100 mA電轉的i-GONAD，實驗觀察到100 mA電流在C57BL / 6小鼠品系中產生最一致和最佳的結果，在這種電穿孔條件下，在Tyr locus中獲得了96％的indel突變效率。 電流200mA以上的時候基因編輯效率高達100%，但是小鼠胚胎數量會變少，因此作者推薦大部分小鼠品系選擇電流的時候選擇50-200mA區間范圍（50mA，100mA，150mA，200mA）。

Nature Protocol中電轉條件為CUY21Edit II: square (mA), (+/?), Pd V (voltage of the pulses): 60 V or 80 V, Pd A (current of the pulses): 100–150 mA, Pd on: 5.00 ms, Pd off: 50 ms, Pd N (pulse cycle): 3, decay: 10%, decaytype: Log

GONAD后植入前小鼠胚胎中的熒光。（a）-（c）從MCH（ICR）雌性收集的兩細胞胚胎，在注射溶液后進行i-GONAD實驗流程，含有四甲基羅丹明標記的葡聚糖3kDa（紅色），EGFP mRNA（綠色），注意觀察到的胚胎既有紅色也有綠色，（d）至（f）為從MCH（ICR）雌性收集的兩細胞胚胎經過類似處理的對照組實驗結果 。可以觀察到CUY21Edit II電轉效率非常高。

CUY21EDITⅡ電轉儀：

?通過該儀器實現了精確的矩形波和雙脈沖衰減脈沖波輸出

?可以用于體內和體外實驗的真正的電基因轉移裝置

?業界首款恒流脈沖輸出

?恒定電流脈沖非常適合諸如GONAD之類的體內電轉

?出色的觸摸屏操作性

?記錄所有輸出脈沖的執行電壓和電流值

?輸出脈沖記錄可以導出到USB存儲器

在電轉實驗中，電穿孔造成細胞損壞程度主要取決于電流大小，電流值決定電穿孔的成敗。

示例）在鑷子型電極之間夾有樣品（卵形管）時即使電壓相同，根據電極之間的距離和電極的狀態（氧化等），流過的電流也不同。

CUY21 EDIT II能夠實時檢測電阻，控制電壓，產生恒流的電流脈沖輸出。換句話說，將輸卵管夾在鑷子型電極之間的GONAD實驗中，即使各實驗之間的夾持力不同，電流依然保持恒定值。在多種具有許多參數變量的體內電穿孔，可以保持電參數固定，帶給您更好的實驗重復性和更高的基因導入/編輯效率。

CUY21 EDIT II電轉儀滿足所有活體電轉，原代細胞（如原代神經元），貼壁細胞，難轉染細胞等的高效基因轉化電轉過程無需特殊溶液，為您節省成本，減少操作，提升效率。

文獻來源：

Nat Protoc. 2019 Aug;14(8):2452-2482. doi: 10.1038/s41596-019-0187-x.