Western Blot實驗的進化：從管家蛋白到總蛋白歸一化

        自1979年首次發表以來，Western Blot（WB）實驗一直是測定復雜生物樣品中蛋白質相對表達的一項關鍵技術。隨著實驗技術的發展和技術的進步，文章發表越來越注重標準化和數據的可重復性。歸一化是WB實驗中重要的內部控制過程，通過簡單的數學運算，降低泳道之間和樣品之間難以避免的上樣差異。通常WB實驗的內參為不受實驗影響的內源性蛋白。將內參蛋白作為上樣濃度的指標。

大部分WB實驗都使用管家蛋白（Housekeeping proteins）作為內參蛋白，通常使用的管家蛋白為：肌動蛋白（如：β-actin），微管蛋白（如：α-tubulin），3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。通常，這些管家蛋白在細胞和組織中高度表達，但是管家蛋白在實驗中也經常受到病理條件和實驗條件的影響。例如，細胞匯合度（Cell Confluence），上樣蛋白總量和細胞/組織類型都有可能影響看家蛋白的表達水平。例如，NIH3T3成纖維細胞中細胞匯合度從10%增加到100%的過程中（細胞瓶長滿的過程），α-tubulin和GAPDH表達明顯增加。WB實驗在較大的總蛋白量上樣量條件下，β-actin的一抗會無法檢測蛋白含量變化。不同的研究如果使用的看家蛋白不一致，很難進行相互之間的比較，數據分析和解釋也會不準確。如果研究人員希望使用看家蛋白作為歸一化方式，還需要驗證這個看家蛋白不受實驗條件的影響。因此一種不受實驗條件影響的，統一的歸一化方法顯得非常有必要。

總蛋白歸一化（Total protein normalization）是目前最可靠的WB實驗蛋白歸一化方法。總蛋白歸一化在靈敏度，可重復性方面均優于看家蛋白實驗方式，研究者需要熒光成像系統和熒光染料標記的二抗，就可以進行總蛋白歸一化精確定量上樣蛋白。一般來說，總蛋白歸一化適合高表達量和低表達量的目的蛋白檢測，常見的看家蛋白僅僅適合高表達量的目的蛋白檢測。如果一定要使用看家蛋白進行WB實驗，現在的期刊要求研究者：1）測定看家蛋白和目的蛋白的線性范圍，2）在不同的實驗條件下證明看家蛋白不受到實驗條件影響，3）補充信息驗證一抗的特異性，或者建議至少使用兩種看家蛋白，一種表達量高，一種表達量低，作為內參進行歸一化。由于實驗課題通常包含多個目的蛋白的檢測，多次重復看家蛋白的標準曲線會增加相當大的工作量，因此使用蛋白歸一化可以減少工作量，節約研究者寶貴的時間。

圖1. 證實了β-actin和β-tubulin在病理組織中表達改變。 SMA脊髓提取物中檢測肌動蛋白和微管蛋白。 A.綠色（42 kDa）的β-actin條帶與總蛋白染色的凝膠（紅色）重疊。 B.以總蛋白染色的凝膠（紅色）覆蓋綠色（60 kDa）的β-tubulin條帶。 C.當比較SMA小鼠（SMA）與野生型對照（WT）時，β-actin（黑色條）和β-tubulin（灰色條）的表達水平的百分比變化的定量結果。 總蛋白染色（白條）用作對照。

很多文章將總蛋白歸一化與常見的看家蛋白進行比較，證明了在定量WB實驗中，相同的上樣量條件下，常見的看家蛋白會在組織中差異表達。例如，在脊髓性肌萎縮癥小鼠模型中，與健康野生小鼠相比，疾病組β-actin和β-tubulin在脊髓組織中的表達量都會減少，β-actin表達降低了19.3±2%，β-tubulin表達降低了7.3±0.5%。如果使用了β-actin作為WB實驗的看家蛋白作為內參，WB的定量實驗數據結果可能偏離了20%。看家蛋白作為上樣內參（Loading control）的時候，線性范圍非常窄，極大的限制了研究者的實驗設計，難以滿足WB實驗的定量需求。

圖3. 蛋白質稀釋系列的定量顯示β-actin（黑色圓圈）和β-tubulin（空心三角形）的線性范圍。 β-tubulin的線性范圍<10μg。

看家蛋白的表達差異不僅存在于神經系統中，在骨骼、脂肪和內部器官在內的多種組織中，都能檢測到看家蛋白的表達差異。實驗結果顯示，在心臟和脾臟組織之間觀察到了β-actin表達差異最為明顯。在幾乎相同的蛋白上樣量的實驗條件下，β-actin表達量出現了明顯的差異表達，如果這些實驗均使用β-actin作為看家蛋白歸一化，引入的誤差可能相差20%以上。因此，研究結果和期刊雜志都建議使用總蛋白表達量作為蛋白上樣量的指標，從而對多種組織和實驗中的表達結果進行比較和分析。

圖2. β-actin表達的比較分析在廣泛的組織中變化很大。A.評估β-actin表達的組織樣品的代表性圖像。 從左到右：肌肉（腓腸肌），心臟，骨骼（股骨），顱骨，脾臟和脂肪（性腺）。 比例尺= 1 cm。 B. 定量WB實驗顯示了肌肉，心臟，骨骼，顱骨，脾臟和脂肪提取物中的β-肌動蛋白表達（綠色）存在很大差異。 總蛋白染色凝膠圖像（紅色）覆蓋在作為對照。 C.對于不同分子量范圍的總蛋白質測量結果表明，在不同組織樣品中蛋白質上樣的準確性。 D.堆疊的條形圖，顯示了所檢查的每個組織的β-actin（綠色條）和總蛋白質測量值（紅色條）的比較變異性。

圖4. （左圖）AzureRed與三種目標蛋白質同時成像。 在Azure成像系統上成像。 （右圖）與普通管家蛋白相比，AzureRed具有更寬的線性動態范圍。

Azure Biosystem公司的AzureRed總蛋白染色，對Western Blot實驗流程造成最小干擾的情況下，研究者可以輕松地對總蛋白進行染色和歸一化。在定量檢測WB實驗中，明顯優于常規的看家蛋白，高重復性，寬動態范圍，使得AzureRed總蛋白染色非常適合研究人員進行中蛋白歸一化。

簡單—AzureRed是可逆的染料，與基于下游抗體的檢測兼容
一致—AzureRed發出的信號可再現，不受組織類型和實驗條件的影響
準確—AzureRed在寬動態范圍（> 3 logs）內呈線性，可實現可靠的定量
靈活— AzureRed可與熒光標記的抗體以及化學發光檢測系統一起使用

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